SEM图像解读-1 图片本身给出的信息
前言
扫描电镜作为一种重要的成像工具，最重要的输出结果自然是图像。在电镜测试中，我们通常以看到图像开始，也是以获得和解读图像为终。所以本文将从图像的一些简单概念入手，最后由图片信息判断参数是否合适，以帮助读者加深对扫描电镜及图像的认识和理解，也指导我们在拍摄时调节参数。
1 图片给出的信息
1.1 图像尺寸、像素、灰度和位深度
查看扫描电镜的图像，会发现图像属性的详细消息中有很多术语。比如在图1a中，就可以看到“分辨率”、“水平分辨率”和“位深度”等，它们分别代表什么意义呢？
在图中，“分辨率”值为1280×960，即宽度方向和高度方向上像素数量的乘积，乘积算出的值就是像素数，即1280×960≈123万（像素）。而“水平分辨率”和“垂直分辨率”，数值是256 dpi ，它们是在对应方向上一英寸上的像素数量，即像素密度（像素/英寸），其数值越高表示图像的解析度越高。
需要注意的是，这些有关图像的术语都不是我们通常谈及的“电镜的分辨率”，那是指分辨细节的能力。像素乘积的“分辨率”术语，在电镜中被称为Capture resolution、Data size或者Store resolution，本文使用图像尺寸的概念来称呼，以方便与“电镜的分辨率”相区分。
.jpg)
图1 图像的尺寸和像素
我们可以在采集图像前按需设置图像尺寸。对于扫描电镜原始图像而言，尺寸太小（像素太少）的图像特征粗糙、缺乏过渡，容易马赛克化；而大尺寸的图像可以在后期把图像放得更大，并能观察其细节、颜色过渡和层次感。但是扫描电镜的图像尺寸也不是越大越好，太多的像素会延长采集图片的时间，或降低每个像素上的信号强度，以及导致图像漂移等不利因素。
除非后处理着色，原始的电镜图像是黑白像，亦即灰度像。图1b是一幅SEM图像，通常在图像下部有一些重要信息，比如标尺和电镜参数等。如果我们将电镜图像放大，直至可以分辨出“棋盘格”上单个的方块，如图1c所示。此时每个独立方块就是一个像素（pixel，也被称为picture element或者image element），它是图像的最小单元，且只对应一个灰度值。
图像上的特征识别基于像素间显示的差别，因此每个像素的灰度值跟信号强度要一一对应，这首先需要对灰度值进行量化。对于黑白图像，如果从弱到强分了256个灰度值（色阶），设定最暗的是纯黑（0），最亮的是纯白（255），中间灰度值介于0~255之间，可以完全满足人眼对灰度图像的识别。参见图1c所示的像素队列及其对应的灰度值。
计算机使用二进制，十进制的256即28，对应二进制就是8位，即位深度值为8（见图1a）。位深度通俗讲就是颜色或灰度的梯度范围。对于彩色图像，因为彩色要分非常多的色阶，位深度会比较高，通常为24。而对于电镜图像，因为是黑白像，故通常不需要那么多色阶，通常为8，也可以按需设置较大的位深度。
1.2 放大倍数和标尺
作为显微图片，知道被放大了多少倍才能计算观察物的尺寸，所以图片会给出放大倍数。放大倍数的介绍见专栏6，它是图像宽度跟样品上扫描宽度子比，也是图像像素跟样品像素之比。按直觉，放大倍数越大，细节被放大的越大，但是有两个问题需要注意：
一是放大倍数不是越大越好。放大倍数越大视场就越小。最重要的是，在很高的放大倍数下，样品像素急剧变小，加上束斑尺寸和信号作用区的限制，受限于扫描电镜分辨能力和样品本身特征，图像会变得模糊。还应根据特征的尺寸设置放大倍数和像素尺寸。在高分辨成像时，为满足奈奎斯特采样定律，应使样品像素约为分辨率极限的三分之一或二分之一，甚至更小，从而使最小细节的显示不受显示的像素大小的限制。
二是放大倍数的定义存在差异：一种常用定义把像宽L设定为12.7 cm（早期冲洗照片的宽度），被称为照片放大率（Photo magnification）或宝丽来（Polaroid）放大；另一种定义把L设定为显示器上图像的大小，被称为屏幕放大率（Display magnification）。对同一物宽度l，两种放大倍数显然会存在不一致。如今的显示器尺寸大于12.7 cm，所以后一种定义的倍率数值较大。
另外，对原图像的显示和处理会导致放大倍数变化，比如对图像进行分割或放大。就如地图要标识比例尺一样，电镜照片中也要有标尺（Scale bar或者Mini marker），如图1b所示，标尺随着图像缩放，也有测量功能。因此，不同电镜图像间的尺寸比对应以标尺为参照，而不是单纯通过放大倍数进行比较。如图2使用Nano Measurer测量颗粒尺寸，软件需要预先设置标尺，而不是给出放大倍数。
.jpg)
图2 依据标尺测量颗粒尺寸
1.3 图片中的参数信息
除了放大倍数和标尺外，扫描电镜的图片通常还会给出加速电压、工作距离、探测器型号等关键信息。
.jpg)
图3 图片上的重要参数
知道这些信息，除了可以让我们后续可以复现和对比实验外，还能判断图片拍摄者参数设置是否合理，图片质量跟参数有无关联等，见本栏第三节内容。
2 图片的亮度和对比度
有些厂家的图片可以用记事本打开，除查看以上数据外还能查看很多参数，比如拍摄时的亮度和对比度，见图4所示。
.jpg)
图4 记事本打开图片呈现的参数信息
对于扫描电镜图像，图像亮度（brightness）指图像的明亮程度，整幅图灰度值越高则图像越亮。而对比度（contrast）指的是最高和最低灰度值之间的差别，对比度越高，图像越明锐、层次突出、样品特征明显。但是太高的对比度会导致部分区域过曝或者欠曝，也会让噪点变得明显。
为了获得满意的图像，一般需要亮度和对比度搭配进行调节。以图5锡球图像的灰度/对比度调节过程为例。若图像的位深度为8，则图像灰度值的范围为0~255，坐标轴上0为黑，255为白。我们拾取图像中间处水平线的像素-灰度值曲线，然后进行灰度/对比度调节使得图像更清晰，特征更明显。
.jpg)
图5 图像的亮度/对比度调节原理
图5a的图像灰暗且特征不清晰，因为曲线整体的强度值不高，最高灰度值和最低灰度值的差别也不是很大。首先，使用亮度调节：通过增加信号的直流分量来提高曲线整体的强度值，使图像整体变亮，但是图像还不够明锐、层次不突出，如图5b所示。第二步可以调节图像对比度：通过提高信号增益，使大部分信号都位于0~255的范围内，从而得到清晰、明锐、层次分明的图像，如图5c所示。过度增加亮度或者增加对比度，会使灰度值超出探测器的动态范围，出现过曝或欠曝的区域，丢失其中的细节信息，如图5d所示锡球边缘存在过曝。
在很多情况下，亮度值设置在50%左右，根据信号强度调节对比度，则较易达到满意的效果。对于亮度/对比度的调节，若试样表面平坦且各处差别不大，可以加大对比度，以突出特征区域；若试样本身产生强烈的明暗对比，则可以降低对比度。需要说明的是，对图像质量的判断有很大的主观，对比度/亮度调节可在反应客观的前提下按个人喜好或者目的进行。
除了手工调节亮度/对比度外，目前的电镜软件都具有自动调节对比度和亮度的功能，或者直方图修正工具、伽马调节等手段。
3 由图片信息判断参数是否合适
许多时候需要比对图片或者复现或改进实验，此时先前图片的信息可以提供很好的线索，用以判断参数是否合适，需要在那些方面进行改进。
下边举几个例子，并假设左侧的图片参数设置有问题，通过更改设置后得到较为理想的图像。通过这些案例，反过来也告诉我们：合适的设置参数对图像质量的影响。
3.1 加速电压选择不合适
加速电压是极其重要的设置参数（专栏7），很多时候决定了表征的效果。
锂离子电池隔膜为有机物材料（聚烯烃类），熔点不高，易受电子束辐照损伤，所以图6左图在高电压下发生了变形，而且表面细节并不突出，将加速电压降低得以改善。
.jpg)
图6 锂离子电池隔膜的图像
图7所示的样品表面有些氧化层，使用背散射电子探测器（BSD/SSD/DBS），加速电压太低时信号来自表层，加之探测器对高能电子更敏感，所以左图并不理想。增加加速电压可能得到理想的结果，如右图所示。
.jpg)
图7 抛光后钢铁的图像
对于绝缘样品，加速电压选择不合适也容易导致荷电。左图荷电效应明显，通过尝试改变加速电压，使得荷电效应减弱。
.jpg)
图8 硅片上有机物的图像
3.2 工作距离选择不合适
工作距离是非常重要的设置参数（专栏6），在高倍时往往需要降低工作距离。左图图像质量较差，因为工作距离太大，降低工作距离后得到右图，清晰度大为改善。
.jpg)
图9 纳米二氧化硅球（团聚）的图像
3.3 束流等参数不合适
束流对图像质量的影响也非常大（专栏7）。对于碳上的白金颗粒，左图有些模糊，光阑（Aperture）选择了7（对应 120 μm），在高倍时过大。选择1（对应 30 μm），图像清晰度和锐度大为改善。
.jpg)
图10 碳上白金颗粒的图像
3.4 探测器等参数不合适
场发射扫描电镜中往往安装多个探测器，特点鲜明。对一个不干净的抛光金属，左图难以看到各晶粒的取向和晶界，反而能看到一些污染物。该电镜的SE2探测器会接收一些二次电子，反映了较多表面信息。右图使用了背散射探测器BSD，晶粒的取向和晶界清晰可见。
.jpg)
图11 石墨烯上白金颗粒的图像
3.5 亮度对比度调节不合适
对于石墨烯上的白金颗粒，左图整体上细节不突出，锐度也不佳，一些小金属颗粒也难以看到。显示更多设置信息，并找到了原因：左图的亮度值太高而对比度值又太低。调低亮度，增加对比度，右图的图像质量大为改善。还可以使用后处理，调节左图的亮度/对比度。
.jpg)
图12 石墨烯上白金颗粒的图像
当然，图片上不可能给出所有参数信息，有时还需要借助其他方式显示更多参数，比如ImageJ/Fiji软件及插件，也可以在电镜软件上增加显示的设置参数。
在电镜图像中，不同区域间存在的明暗程度的差异，这些差异给我们提供信息，让我们解读图像反映的样品特征，下一篇专栏文章我们将会了解图像的衬度。
精彩回顾
参考文献
(1) 施明哲. 扫描电镜和能谱仪的原理与实用分析技术[M]. 电子工业出版社, 2015.
(2) 张大同. 扫描电镜与能谱仪分析技术[M]. 华南理工大学出版社, 2009.
(3) 高尚，杨振英，马清，等. 扫描电镜与显微分析的原理、技术及进展[M]. 广州: 华南理工大学出版社，2021.
(4) Reimer L. Scanning Electron Microscopy — Physics of Image Formation and Microanalysis, 2nd [M]. Springer, 1998.
(5) Goldstein J, Newbury, D E, et al. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, 3rd[M]. Springer, 2003.
(6) Goldstein J, Newbury, D E, et al. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, 4th[M]. Springer, 2018.
(7) Ul-Hamid, A. A beginners' guide to scanning electron microscopy[M]. Springer, 2018.
(8) Suga M, Asahina S, Sakuda Y, et al. Recent progress in scanning electron microscopy for the characterization of fine structural details of nano materials[J]. Progress in Solid State Chemistry, 2014, 42(1): 1-21.
(9) Xing Q. Information or resolution: Which is required from an SEM to study bulk inorganic materials?[J]. Scanning, 2016, 38(6): 864-879.
(10) Liu Zheng, Fujita Nobuhisa, Miyasaka Keiichi,et al. A review of fine structures of nanoporous materials as evidenced by microscopic methods[J]. Microscopy, 2013(1):109-146
*** 以上内容均为原创，如需转载，请注明出处 ***
400-850-4050
